¿Cuál es el método de detección de actividad de proteasa alcalina?
¿Cuál es el método de detección de actividad de proteasa alcalina?
La actividad de la enzima se refiere a la capacidad de una enzima para catalizar ciertas reacciones químicas. El tamaño de la actividad enzimática puede expresarse por la velocidad de una determinada reacción química que cataliza en las condiciones correspondientes. La medición de la actividad de la enzima proteasa alcalina de Liaoning es en realidad la velocidad de la reacción química catalizada por la enzima. La velocidad de la reacción enzimática puede expresarse mediante la disminución del sustrato de reacción o el aumento del producto por unidad de tiempo. En aras de la sensibilidad, generalmente se mide la cantidad de producto producido por unidad de tiempo. Dado que la velocidad de la reacción enzimática puede disminuir gradualmente su valor de aumento con el tiempo, para medir correctamente la actividad enzimática, se debe determinar la velocidad inicial de la reacción enzimática.
Principio de determinación de actividad de proteasa alcalina Principio de método de folina
La proteasa alcalina puede catalizar la hidrólisis de caseína a tirosina en condiciones alcalinas. La tirosina es un aminoácido que contiene un grupo hidroxilo fenólico y puede reaccionar con Folin (una mezcla de ácido fosfotungstástico y ácido fosfomolibódico). (Reacción de fenol folínico: el reactivo de folina es extremadamente inestable en condiciones alcalinas, y es fácil reducir cuantitativamente los compuestos fenólicos para producir una mezcla de azul de tungsteno y azul de molibdeno, que muestra un tono diferente de azul). se puede determinar la cantidad de tirosina producida, y la cantidad de tirosina producida por la hidrólisis de caseína por la proteasa alcalina de Liaoning en una unidad de tiempo se usa para expresar la actividad enzimática, calculando así la actividad enzimática.
Procedimiento experimental para determinar la actividad de la proteasa alcalina.
Preparación de la solución enzimática: pese con precisión 1 g (± 0.001) de polvo enzimático seco, agregue 10 ml de solución tampón (2.2.5), disuelva en un vaso pequeño y agite con una varilla de vidrio. Después de estar un rato parado, vierta cuidadosamente la solución de la capa superior en un matraz volumétrico. En el medio, agregue una pequeña cantidad de solución tampón a la parte del sedimento, agite y disuelva 4 veces de esta manera, y finalmente transfiera todo a un matraz volumétrico de 100 ml. . Haga las paces con la solución tampón, agite bien y filtre con cuatro capas de gasa. Extraiga 5 ml del filtrado, transfiéralo a un matraz volumétrico de 100 ml, diluya hasta la marca con agua destilada y diluya el líquido enzimático con un nivel de 2000 veces.
Definición de actividad de proteasa alcalina
Definición de unidad de actividad de proteasa alcalina: 1 gramo de polvo de proteasa alcalina puede producir 1 microgramo de tirosina por minuto en condiciones de pH 10 y 40 ° C, que se considera una unidad de actividad enzimática.
Precauciones para la determinación de la actividad de la proteasa alcalina.
1. La temperatura, el pH y el tiempo de la reacción enzimática tienen un impacto directo en el número de enlaces peptídicos hidrolizados, por lo que debe controlarse estrictamente.
2. Después de terminar la reacción con ácido tricloroacético, el filtrado obtenido al filtrar la mezcla de reacción debe ser transparente.
3. Debido a que el reactivo Folin es sensible al ambiente ácido y es propenso a cambiar, existe una estipulación en el orden durante la medición. Es necesario agregar una solución de carbonato de sodio para formar un ambiente alcalino, y luego agregar el reactivo Folin para que funcione normalmente.
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